ARTICLE ORIGINAL
Une méthode pour la préparation rapide de Tissus Frais pour le Microscope
Dr Louis B. Wilson
JAMA. 1905;45(9):1737
Quand je travaillais en pathologie générale, j'ai partagé la méfiance communément répandue au sujet de l’usage de sections gelées de tissus frais pour diagnostic microscopique. En prenant récemment la charge du laboratoire des chirurgiens, du Dr. Mayo, j'ai testé avec soin différentes méthodes publiées jusqu'ici et les ai trouvées aussi lentes l'une que l'autre concernant l’obtention des résultats pendant que les patients attendaient sous anesthésie et j’obtenais un compte-rendu cellulaire assez pauvre. Après une expérimentation considérable la technique suivante a été découverte, et au cours des six derniers mois elle a produit des préparations uniformément excellentes:
1. Les morceaux de tissu frais de moins de 2X10X10 mm sont congelés dans la solution de dextrine et découpés en sections de 10 à 15 microns d’épaisseur.
2. Les sections sont retirées du couteau avec la pointe du doigt et mises à dégeler.
3. Les sections sont déroulées avec des brosses à poils de chameau dans une solution de NaCl à 1%.
4. Les sections sont colorées 10 à 20 secondes dans une solution polychrome neutre de bleu de méthylène d'Unna.
5. Elles sont lavées dehors dans une solution de NaCl à 1%.
6. Elles sont montées dans le milieu glucosé de Brun.
Le microtome que j'utilise est le Spencer automatique avec un apport de CO2, dans lequel l'ébonite est substituée au cuivre dans le mur de la chambre réfrigérante, donc isolant la plaque réfrigérante. Le dégel de la section au doigt empêche la formation de bulles dans une grande mesure. Les brosses en poils de chameaux utilisées par les artistes sont beaucoup plus utiles pour manier des tissus que celles fournies habituellement par les maisons d’approvisionnement des laboratoires. Un verre de montre lourd, peu profond sur une surface noire est le meilleur récipient où dérouler des sections. Les sections sont maniées au mieux par une arracheuse formée dans une petite tringle du verre courbé à angle adéquat. La section est constamment mise en mouvement pendant la coloration. La coloration est contenue dans une toute petite tasse pour faciliter la récupération rapide de la section au moyen de l’arracheuse. Le lavage est effectué dans plusieurs onces de solution salée dans un plat en porcelaine blanc et est continué tandis que la coloration part librement. Le milieu glucosé moyen de Brun (qui est fait d’un mélange d'eau distillée 140 c.c., glucose 40 c.c., et glycérine 10 c.c., auquel on a ajouté de la solution camphrée 10 c.c. ensuite filtré), est contenu dans un plat ovale de porcelaine (un modèle "non décoré épousant parfaitement la forme") d'une telle dimension qu’une lame de trois pouces d’un côté, part du fond du plat jusqu’à l’autre bord. La section est étalée sur la lame quand elle est dans cette position. La lame est retirée alors avec soin du plat, le liquide en excès est enlevé, une lamelle couvre-objet est placée sur la section et le spécimen est prêt pour le microscope.
Le processus entier prend une minute et demie depuis le moment où le tissu est placé sur la plaque réfrigérante du microtome jusqu'à ce que le spécimen coloré soit sur la plaque du microscope. Le coloris résultant est uniformément bon avec les éléments du tissu bien contrastés en rouge vif, pourpre et bleu sombre.
Un diagnostic peut être fait avec de telles préparations dans un grand pourcentage de cas chirurgicaux dans lesquels un diagnostic est possible par l'étude de sections de la même épaisseur de coupe de tissus fixes et colorés avec de l’hématoxyline et de l’éosine.
Voir www.jama.com pour une forme PDF de l’article original du JAMA.
En 1905, le JAMA publiait un bref rapport avec l’autorisation du Pathologiste et bactériologue de la Clinique Mayo Louis B. Wilson 1, dans lequel il a esquissé une méthode par laquelle du tissu frais prélevé pendant la chirurgie a été examiné pour un diagnostic microscopique immédiat. Ce n'était pas la première communication sur la préparation rapide de tissus frais pour contrôle au microscope, 2,3 mais les améliorations de Wilson ont autorisé l’application de la méthode à chaque prélèvement chirurgical effectué à la Clinique Mayo. Ce changement opérationnel a annoncé pour les chirurgiens et les pathologistes le commencement de la "section gelée" et, en retour, ce qui est connu aujourd'hui comme "pathologie chirurgicale", une sous-spécialité dans le contexte plus général de la pathologie post-mortem. 4
Les détails historiques rapportés dans les lignes initiales et suivantes ont été décrits par Gal et Cagle 5 en 2005, lors de la célébration du centième anniversaire de l'article de Wilson. Dans ce commentaire, nous fournissons une brève perspective de la pratique de section gelée de la Clinique Mayo sur des années et tentons une estimation des futures perspectives de cette technique.
Comme les répercussions de la pratique de Wilson se sont étendues au delà de la Clinique Mayo, les réactions n'étaient pas toujours favorables.
Beaucoup de pathologistes académiques se sont interrogés sur la pertinence et l’exactitude de tels diagnostics intra-opératoires rapides, 4 bien que les études plus tardives aient montré que la pratique de la section gelée à la Clinique Mayo est aussi exacte que celles pratiquées dans d'autres institutions. 6
Plusieurs facteurs supplémentaires ont influencé une réaction négative, pour le moins c’était la nécessité pour les pathologistes d’être continuellement disponibles pendant la chirurgie et le fait que la plupart des salles d’opération d’alors (et même d’aujourd'hui) n'a pas été conçue pour la présence de pathologistes et de leur matériel pour examen microscopique immédiat de tissus.
La plupart des chirurgiens ont adopté finalement la méthode du cryostat pour réaliser la technique de la section gelée, une technique qui implique des tissus plus lents à refroidir et présente des défis techniques et de potentiels artefacts (surtout quand il s’agissait de tissus gras). La Clinique Mayo de Rochester continue de réaliser la méthode utilisée par Wilson avec le microtome réfrigérant qui est plus rapide et utilise une température de réfrigération plus basse, permettant à l'opérateur d’obtenir des sections lisibles de tissus qui contiennent de la graisse (biopsies de poitrine, bord de la poitrine et nodules lymphatiques gras), typiquement en 1 minute ou moins. Malgré les nombreux avantages de cette méthode de procédure par section gelée, la nature intensive en termes de temps et "émergente" de la procédure par section gelée, les coûts et le personnel spécialisés nécessaires, et le besoin d’extrême rigueur diagnostique de la part des pathologistes impliqués ont joué indubitablement un rôle considérable dans l’établissement des préjugés contre le modèle de chirurgien et pathologiste "lié à la hanche" pendant la chirurgie.
En dépit des obstacles qui limitent une applicabilité plus généralisée de la méthode utilisée par Wilson, le travail de collaboration établi en 1905 entre les chirurgiens et les pathologistes de la Clinique Mayo s’est accru au cours des années et est resté bien vivant jusqu’à nos jours. Comme le navigateur d'un avion, les pathologistes continuent de jouer un rôle constant pendant la chirurgie. Les techniques ont évolué avec du matériel avancés (tel que le remplacement du bioxyde de carbone en aérosol par un réfrigérant clos) mais la philosophie sous-jacente reste la même: l'information diagnostique du pathologiste est vitale au chirurgien au cours de l’opération. En fait, non seulement des diagnostics critiques sont effectués pendant l’opération depuis au moins un siècle, dans la plupart des cas des spécimens l'évaluation entière est exécutée pendant la procédure chirurgicale, avec l'intention d’avoir un dossier complet et définitif au sujet de l’anatomopathologiste avant que le patient ne retourne dans sa chambre d’hôpital. Augmenter la rapidité dans la section du tissu producteur et estimer le caractère complet de la pathologie pendant la chirurgie demeurent le but recherché.
En revanche, les techniques typiques de section gelée d'autres hôpitaux sont considérablement plus longues à exécuter et sont utilisées pour des applications très limitées et des questions très ciblées (par exemple : est-ce une tumeur? Ce tissu est-il adéquat dans un but diagnostique?).
L'attachement à la méthode de la section gelée à la Clinique Mayo Rochester a montré les avantages tangibles pour les Pathologistes de la Clinique Mayo. Avec autant de tissus, examinés régulièrement par la méthode de la section gelée, les opérateurs sont devenus très compétents et la compétence des pathologistes ainsi que celle des diagnostiqueurs s’est améliorée progressivement. Le processus, un peu laborieux, exige de l’expérience et une gestion appropriée de la part de l’équipe.
En vue de faire ressortir ce point, Dahlin, un pathologiste de la Clinique Mayo, a déclaré dans un éditorial de 1980 faisant le point à propos des 75 premières années de sections gelées à la Clinique Mayo: Les personnes habituellement insuffisamment formées à cette méthode désapprouvent la technique. L’essentiel pour une interprétation correcte, c’est un pathologiste compétent et des sections de bonne qualité. 7 Les défis substantiels associés à la technique ont été accentués quand des branches de la Clinique Mayo se sont établies en Floride (1986) et en Arizona (1987). Les deux emplacements ont trouvé que dupliquer le processus exactement comme exécuté à Rochester, Minnesota, n'était pas possible ou très coûteux. À ces endroits, les sections gelées sont encore traitées plus librement que dans la plupart des centres à travers les États-Unis, mais pas avec le même matériel, ni la même intensité, ni le même niveau de recrutement du personnel que ceux de la Clinique Mayo de Rochester. Il semblerait que ce phénomène commencé en 1905 soit spécifique de par son origine.Comme l’avenir de la pratique des sections gelées, les défis relevés à la Clinique Mayo reflètent aujourd'hui une tendance mondiale vers plus toujours plus de spécialisation dans la formation de la pathologie. 8 Avec les nouvelles générations de pathologistes émergeants avec une grande connaissance concentrée sur des thèmes de spécialité plus précis, les généralistes laissés pour s’occuper des séries de section gelée sont peut être une espèce en voie de disparition. 9 L'alternative improbable exige des sous-spécialités multiples (10 ou plus), une optimisation de duplication et, attendant des pièces de leur organe de prédilection.
La Clinique Mayo s’est adaptée à ce problème, en partie, en se servant de la compétence offerte par les nombreux pathologistes des sous-spécialités et travaillant dans leurs bureaux via les connections du vidéo-microscope .Une adaptation limitée par la disponibilité du consultant.Une autre question critique est mise en évidence avec des maladies particulières (par exemple,
les lymphomes) qui exigent des tests diagnostics spéciaux avant qu’un diagnostic final puisse être donné. A la Clinique Mayo Rochester actuellement l'adéquation de tel pièces de tissu et le diagnostic final pour ces cas sont rendus après chirurgie et après étude immuno-histochimique et tests de diagnostic moléculaire. Il n’est pas irréaliste d’envisager un moment où la pathologie de presque chaque système de l'organe (certainement la pathologie tumorale) exigera une analyse post-chirurgicale spécialisée fournissant des informations pour des thérapies non chirurgicales, mais à visée médicale. À la Clinique Mayo, à Rochester, le but reste de mener à bonne fin, aussi souvent que possible le diagnostic de la pathologie pendant la chirurgie et de rapporter les résultats de tests subordonnés comme un addenda le jour suivant.Il reste deux questions: est-ce que le feedback de l’anatomo-pathologie est vraiment utile au chirurgien aujourd'hui ? Et est-ce que cette pratique conduit elle-même à satisfaire les demandes toujours croissantes de l’âge de la génétique moléculaire pour laquelle de plus en plus d'informations pour le diagnostic, la thérapie, et le pronostic sont glanées à partir du plus petit tissu ou échantillon de sang du patient? En dépit des défis esquissés, nous croyons que "guider la main du chirurgien" restera une partie intégrante d’une pratique de la pathologie chirurgicale de qualité.
Sans cette collaboration d’importantes occasions seraient perdues, telles que déterminer l'adéquation des marges d’une tumeur, l’estimation d’un tissu pour une thérapie immédiate intra-opératoire, confirmer le diagnostic de présence de tissus permettant une présélection immédiate pour les études spéciales, et identifier toutes les fois où c’est possible la nature sous-jacente à un processus pathologique.
